t载体(直接连接T载体什么原因导致总是连不上)
资讯
2024-02-08
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1. t载体,直接连接T载体什么原因导致总是连不上?
很明显目的片段没有插入成功,但仍然长出菌落的这个现象可能由于以下原因:
1、抗性失效了
2、插入的片段不够纯
3、有杂菌或被实验室里其他含有抗性的大肠杆菌污染了
解决方式可以从以下几个方面考虑:
用的什么抗生素?
长出来菌落的数量多么?如果插入片段浓度不大却长出大量菌落,那可能是污染或者抗生素失效了
测序结果是怎么样的?可以blast一下测序结果看看插入跟你的目的片段的差异情况。
插入片段是多大的?纯化过吗?
连接酶可能失效了。
载体自连了,检查一下酶切位点对不对。
其实,做一个阴性和阳性对照就能大概找到原因。
我两年多没做实验了,可能回答不对,仅供参考。慢慢来,你会找到原因的,祝实验顺利。
2. t载体是平末端还是粘性末端?
t载体是是粘性末端。
3. 用ti质粒作为运载体的原因?
一般载体所具备的基本条件为:
1、能自我复制,并具有一定的拷贝数;
2、带有抗性基因,便于筛选和鉴定;
3、在适当的位置有单酶切位点;
4、带有强启动子,驱动目的基因在宿主细胞内高效表达。
Ti质粒是诱导植物肿瘤的质粒,其结果中的可转移DNA(T-DNA)顺序有促进Ti质粒转移至植物细胞染色体DNA(cDNA)中的作用。T-DNA由20kb组成,可随机整合至植物细胞cDNA中。Ti质粒为环状双螺旋DNA,由185kb组成。
4. t载体连接产物4度可以保存3天吗?
要看你的保存条件了 连接好之后放-20℃ 三天没问题 拿出来可以正常使用 在4℃我最多放过30个小时就用了(效果还不错 没什么影响)如果想保存时间长一些还是建议连接好之后放-20℃ 希望能对你有所帮助!
5. pmd19t质粒载体怎么样?
pMD®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成,在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点,用EcoR V进行酶切反应后,再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC19载体为基础构建而成,所以它具有同pUC19载体相同的功能。此外,本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应,其连接液可以直接用于细菌转化,大大方便了实验操作。本制品中的Control Insert(500 bp)还可以用于Control反应。
6. 为什么pcr扩增得到的目的基因不能直接用于连接反应?
因为有很多杂带不纯,需要先纯化连接t载体测序,还有就是pcr之后两头都带有a碱基,这就是为什么能直接连接t载体的原因,
7. 克隆载体包括哪些?
克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制,从而获得大量克隆化片段 的运载工具,常用的克隆载体种类很多,主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
1.质粒型载体—环状dsDNA分子,自主复制
2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子,形成病毒颗粒
3.混合型载体—具质粒和病毒特性,特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性
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1. t载体,直接连接T载体什么原因导致总是连不上?
很明显目的片段没有插入成功,但仍然长出菌落的这个现象可能由于以下原因:
1、抗性失效了
2、插入的片段不够纯
3、有杂菌或被实验室里其他含有抗性的大肠杆菌污染了
解决方式可以从以下几个方面考虑:
用的什么抗生素?
长出来菌落的数量多么?如果插入片段浓度不大却长出大量菌落,那可能是污染或者抗生素失效了
测序结果是怎么样的?可以blast一下测序结果看看插入跟你的目的片段的差异情况。
插入片段是多大的?纯化过吗?
连接酶可能失效了。
载体自连了,检查一下酶切位点对不对。
其实,做一个阴性和阳性对照就能大概找到原因。
我两年多没做实验了,可能回答不对,仅供参考。慢慢来,你会找到原因的,祝实验顺利。
2. t载体是平末端还是粘性末端?
t载体是是粘性末端。
3. 用ti质粒作为运载体的原因?
一般载体所具备的基本条件为:
1、能自我复制,并具有一定的拷贝数;
2、带有抗性基因,便于筛选和鉴定;
3、在适当的位置有单酶切位点;
4、带有强启动子,驱动目的基因在宿主细胞内高效表达。
Ti质粒是诱导植物肿瘤的质粒,其结果中的可转移DNA(T-DNA)顺序有促进Ti质粒转移至植物细胞染色体DNA(cDNA)中的作用。T-DNA由20kb组成,可随机整合至植物细胞cDNA中。Ti质粒为环状双螺旋DNA,由185kb组成。
4. t载体连接产物4度可以保存3天吗?
要看你的保存条件了 连接好之后放-20℃ 三天没问题 拿出来可以正常使用 在4℃我最多放过30个小时就用了(效果还不错 没什么影响)如果想保存时间长一些还是建议连接好之后放-20℃ 希望能对你有所帮助!
5. pmd19t质粒载体怎么样?
pMD®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物(TA Cloning)的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成,在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了EcoR V识别位点,用EcoR V进行酶切反应后,再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC19载体为基础构建而成,所以它具有同pUC19载体相同的功能。此外,本制品中的高效连接液Solution I可以在短时间内(约30分钟)完成连接反应,其连接液可以直接用于细菌转化,大大方便了实验操作。本制品中的Control Insert(500 bp)还可以用于Control反应。
6. 为什么pcr扩增得到的目的基因不能直接用于连接反应?
因为有很多杂带不纯,需要先纯化连接t载体测序,还有就是pcr之后两头都带有a碱基,这就是为什么能直接连接t载体的原因,
7. 克隆载体包括哪些?
克隆载体就是将目的基因导入宿主细胞进行复制,从而获得大量克隆化片段 的运载工具,常用的克隆载体种类很多,主要包括质粒、粘粒和噬菌体等。
1.质粒型载体—环状dsDNA分子,自主复制
2. 病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子,形成病毒颗粒
3.混合型载体—具质粒和病毒特性,特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性
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